邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种高灵敏度的分子检测方法，专门用于单细胞层面上可视化蛋白质相互作用的研究。该技术利用特异性抗体识别并结合目标蛋白，通过带有寡聚脱氧核苷酸的PLA探针识别并结合一抗。当两个目标蛋白靠近时，两个PLA探针上的DNA会互补配对，随后在连接酶的作用下，DNA片段连接形成环状结构，最终通过滚环扩增（RCA）生成可检测的信号。这一方法可以在亲和探针的帮助下识别近距离（<40nm）的目标分子，从而将蛋白质检测转化为DNA核酸序列的检测来实现对特定蛋白质的检测、定量及定位。与传统的Co-IP蛋白互作验证技术相比，PLA技术不仅可以观察互作蛋白的具体细胞区域，还能结合病理技术，分析某些特定细胞内的蛋白互作情况，利用荧光强度反映蛋白互作的强度，实现真实的可视化研究。

PLA的实验流程通常包括以下几个步骤：（1）样本处理：先用多聚甲醛固定细胞样本，组织样本则需进行脱蜡和切片；（2）封闭：在细胞或组织切片上均匀加入封闭液；（3）孵育一抗：将稀释合适的一抗均匀涂加在封闭好的样本上，并在37°C的湿盒中孵育以确保抗原结合；（4）加入PLA探针：清洗后添加PLUS和MINUS两种PLA探针；（5）连接反应：滴加连接缓冲液，并在37°C温箱中进行连接反应；（6）扩增及成像：洗去连接缓冲液，加入扩增缓冲液，使用荧光显微镜观察目标蛋白之间的相互作用。

PLA在蛋白互作研究中的应用

PLA技术结合了抗体的特异性与PCR的灵敏度，能够敏感地探测蛋白质相互作用。例如，研究者利用PLA技术发现Jurkat细胞中ZAP-70和TCRzeta的互作，发现该互作主要发生在细胞质中。通过荧光显微镜观察，反映蛋白互作的红色荧光信号主要集中在细胞质中，表明ZAP-70与TCRzeta的相互作用显著。

PLA在组织样本中的应用

在帕金森病中，LRRK2激酶的调控作用不容忽视，其活性依赖于pS1292蛋白。当pS1292蛋白与LRRK2结合时，后者将被激活。研究者利用PLA观察LRRK2与pS1292在帕金森大鼠脑组织中多巴胺神经元上的互作，发现未接受鱼藤酮治疗的大鼠中二者几乎没有结合，而鱼藤酮治疗后显著增加了它们的相互作用。PLA技术能够定量分析蛋白质间的相互作用强度，这是传统Co-IP技术难以实现的。

PLA在蛋白与RNA互作研究中的应用

该技术不仅适用于蛋白质之间的互作验证，还可以应用于蛋白质与RNA之间的相互作用。研究者合成了生物素标记的RNA探针并转染细胞，然后用PLA技术验证FXR1蛋白与cMYC mRNA的结合区域，结果表明FXR1蛋白主要结合cMYC的P1、P3及P4片段。通过不同染色结果的对比，证明了FXR1与cMYC的互作主要发生在细胞质中。

此外，PLA技术在生物医学领域的应用十分广泛，包括微量样本的微弱互作检测、单细胞蛋白互作及翻译后修饰、疾病标志物的发掘及药物筛选等研究。综上所述，邻近连接技术（PLA）是一种具有高灵敏度和高特异性的蛋白互作检测工具，展现出广泛的应用前景。随着技术的不断优化与进步，PLA将在更为广泛的领域中发挥重要作用，成为生物医学研究的重要利器，特别是在ag尊龙凯时等品牌的支持下，推动该领域的发展。